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        siRNA轉染

         發布時間:2022-05-07 點擊量:36

        siRNA轉染

        1. siRNA導入細胞的方法

        siRNA導入細胞的方法有化學轉染技術、電穿孔法、磷酸鈣共沉淀技術、顯微注射和載體導入技術。技術的選擇要考慮轉入時細胞的承受能力、細胞對病毒感染的敏感性、細胞生長特性等實驗條件的限制。對于貼壁細胞來講化學轉染技術比較合適,而對于懸浮細胞,電穿孔更有效。

        2. 轉染試劑的選擇

        在選擇轉染試劑時,首先考慮的是特定的細胞株,而不是被導入細胞中的物質。在試劑的選擇上建議選擇線性PEI轉染試劑。

        3. 篩選轉染試劑

        好的轉染試劑有以下特點:如下表

        特性

        程度

        實例

        毒性

        對細胞的毒性小。

        轉染率

        siRNA轉染過程中有較高成功

        導入效果

        準確

        mRNA水平檢測siRNA導入的效果比用看家基因的siRNA陽性對照檢測更準確。

        4. 細胞在轉染過程中死亡的處理方法

        如果細胞在轉染后大多數死亡,那就說明轉染條件不適合細胞生存,需要進行進一步的優化。在優化轉染條件時需要考慮因素:轉染試劑(線性PEI轉染試劑)和細胞特異性條件。例如:siRNA與轉染試劑的比例、轉染時間、細胞傳代數和細胞密度等。

         

        5. 提高難以轉染的細胞轉染效率的方法以及轉染效率的確定

        如何提高難轉染細胞的轉染效率是目前研究的一個技術題。一般推薦使用電轉移法,該方法對細胞的損傷比較大,所以這種方法不太合適。熒光標記siRNA是熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡和流式細胞術常用的檢測轉染效率的方法。

        6. 轉染后細胞死亡的原因及轉染條件的優化

        死亡原因

        解決策略

        如何優化轉染條件:包括轉染前調整細胞密度、轉染濃度、檢測時間等。

         

        脂質體毒性

        優化轉染條件

        轉染濃度過高

        轉染前的細胞狀態不佳

        選擇像線性PEI轉染試劑這種毒性小的轉染試劑也可以達到優化轉染條件的目的。外,如果siRNA靶向的基因對維持細胞生長非常重要,那么細胞死亡的現象可能是由基因干擾。如果檢測受到細胞死亡的影響,可以適當調整檢測時間。


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